PEMISAHAN BIOKIMIAWI PIGMEN MATA Drosophila melanogasterDENGAN THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC)”

Kromatografi merupakan salah satu metode identifikasi yang dapat dilakukan untuk memisahkan suatu campuran berdasarkan perbedaan distribusi dari beberapa komponen pada fasa gerak dan fasa diam. Fasa gerak dapat berupa cairan atau gas, sedangkan fasa diam dapat berupa padatan atau cairan.

Pada Drosophila melanogaster terdapat beberapa tipe warna mata berdasarkan pigmen tertentu yang dipisahkan melalui pemisahan biokimiawi. Perbedaan warna mata pada Drosophila melanogaster normal dan mutan dapat dilihat fenotipenya. Pigmen mata pada Drosophila melanogaster normal maupun mutan dapat dilihat dengan menggunakan metode Thin Layer Chromatography (TLC). Hal ini menjadi latar belakang dilakukannya praktikum pemisahan biokimiawi pigmen mata Drosophila melanogaster dengan metode Thin Layer Chromatography (TLC).

Teori central dogma mempunyai prinsip yaitu protein dibuat dari RNA yang berasal dari DNA. Bunyi dari teori central dogma yaitu ketika DNA ditranskripsi, akan menghasilkan tiga RNA yang berbeda fungsi, yaitu mRNA, tRNA, dan rRNA. Secara singkat, mRNA ditranslasi menjadi protein dan tiap mRNA hasil translasi merupakan produk dari gen spesifik yang menyintesis protein yang berbeda, dengan tujuan untuk meneruskan informasi genetik (Klug, 2006: 232). Aktivitas gen merupakan salah satu faktor yang memengaruhi pembentukan pigmen mata pada Drosophila melanogaster. Ketika terjadi mutasi pada mutan yang bersifat resesif, maka fungsi dari protein hilang. Hal tersebut menyebabkan adanya variasi warna mata pada Drosophila melanogaster mutan, karena terbentuknya pigmen warna mata yang beragam (Wolpert, 2002).

Pigmen warna pada mata Drosophila melanogaster terbentuk melalui dua jalur, yaitu jalur ommochrome coklat dan pteridin merah. Jika kedua jalur sintetis ini terganggu, maka tidak ada pigmen yang dihasilkan dan menyebabkan warna mata pada Drosophila melanogaster berwarna putih. Jika yang terganggu hanya jalur ommochrome, maka mata Drosophila melanogaster berwarna merah terang. Jika yang terganggu hanya jalur pteridin, maka mata Drosophila melanogaster berwarna coklat. Jika sintesis drosopterin terganggu, maka mata Drosophila melanogaster menjadi mutan sepia, warna mata Drosophila melanogaster menjadi lebih gelap karena produksi sepiapterin yang berlebih. Beberapa pigmen yang dapat ditemukan pada jalur ommochrome yaitu kynurenine, N-formylkynurenine, tryptophan, xanthommatin, 3-hydroxykynurenine, dan sebagainya. Sedangkan, pigmen yang dapat ditemukan pada jalur pteridin yaitu biopterin (biru), drosopterin (merah-jingga), isosepiapterin (kuning), isoxanthopterin (violet-biru), sepiapterin, tetrahydropterin, xanthopterin (hijau-biru), 2-amino-4-hydroxypteridin (biru). Warna mata pada Drosophila melanogaster dipengaruhi oleh ada atau tidaknya gangguan pada jalur tertentu saat proses sintesis (Garey, dkk. 2000: 23-24).

Kromatografi merupakan metode untuk memisahkan serta mengidentifikasi suatu komponen kimia di dalam suatu campuran. Prinsip kerja kromatografi yaitu interaksi molekul yang berbeda dengan menggunakan medium stasioner (fase diam) dibawah pengaruh fase gerak. Hal ini menyebabkan komponen kimia tertentu terpisah dari suatu campuran (Sunardi, 2004: 50). Fasa gerak dapat berupa gas atau cairan, sedangkan fasa diam dapat berupa cairan atau padatan (McNair & Miller, 2009).

Berdasarkan fase stasionernya, kromatografi dibedakan menjadi beberapa jenis. Yang pertama, pemisahan molekul antara pelarut dan fase stasioner padat terhadap molekul terlarut yang disebut kromatografi adsorpsi. Kedua, pemisahan molekul antara pelarut dan fase stasioner cair terhadap molekul terlarut yang disebut kromatografi partisi. Ketiga, pemisahan molekul berdasarkan muatan molekul terhadap muatan fase stasioner yang disebut kromatografi pertukaran ion. Keempat, pemisahan molekul berdasarkan ukuran molekul terhadap matriks polimer yang disebut kromatografi penyaringan (Sunardi, 2004: 51). Kromatografi dapat digunakan sebagai metode pemisahan, metode analisis kualitatif, dan metode analisis kuantitafif (Rubiyanto, 2016: 6).

Adsorption chromatography termasuk dalam kromatografi kolom. Adsorption chromatography dapat digunakan untuk memisahkan beberapa senyawa organik, senyawa nonpolar, serta konstituen yang sulit menguap (Sastrohamidjojo, 1991). Metode pemisahan pada adsorption chromatography berdasarkan adsorpsi beberapa komponen campuran dengan perbedaan afinitas terhadap permukaan fase diam. Adsorption chromatography disebut juga kromatografi cair-padat, yang dapat digunakan untuk analisis biokimia dan organik (Suryadarma, 2014). Paper chromatography termasuk kelompok kromatografi planar yang pemisahannya menggunakan medium pemisah dalam bentuk bidang, umumnya bentuk datar yaitu kertas (Sastrohamidjojo, 1991). Prinsip kerja paper chromatography adalah pemisahan beberapa komponen dari substansi berdasarkan distribusi suatu senyawa pada fase diam dan fase gerak, pergerakan pelarut pada kertas, pergerakan komponen pada laju yang berbeda dan pemisahan campuran berdasarkan perbedaan bercak warna (Suryadarma, 2014). Paper chromatography termasuk kromatografi partisi yang metodenya sangat sederhana, dengan menggunakan sepotong kertas, tinta warna, dan pelarut. Dasar prinsip Paper Chromatography adalah proses pemisahan beberapa senyawa berdasarkan interaksi partisi atau distribusi senyawa pada fasa diam. Senyawa terlarut pada fasa gerak akan melewati fasa diam cair yang terdapat pada suatu padatan pendukung (Rubiyanto, 2016: 19-20). Thin Layer Chromatography (TLC) merupakan metode pemisahan komponen sebuah campuran berdasarkan perbedaan polaritas. Prinisp kerja Thin Layer Chromatography (TLC) yaitu ketika gaya kapilaritas menyebabkan larutan naik, maka pigmen akan terbawa ke bagian atas kertas. Karena adanya perbedaan pada kemampuan kelarutan dan kemampuan untuk membentuk ikatan hidrogen dengan kertas kromatografi, maka pigmen yang berbeda akan bergerak dengan jarak yang berbeda. Semakin lemah molekul yang membentuk ikatan, maka semakin cepat pigmen bergerak ke bagian atas kertas (Pack, 2007: 262). Thin Layer Chromatography (TLC) menggunakan perbedaan afinitas analit dengan pergerakan, serta fase diam untuk pemisahan senyawa kompleks dari suatu senyawa (Kumar, 2012: 126). Prinsip kerja adsorption chromatography adalah pemisahan antara zat terlarut serta fase gerak dengan permukaan fase diam.

Proses pemisahan pada metode adsorption chromatography dipengaruhi oleh kekuatan antara adsorben dan solute, serta kekuatan untuk memisahkan solute dari adsorben (Wati, 2014: 85). Retention factor (Rf) merupakan hasil kromatogram yang diuraikan dalam zona tertentu dan dideskripsikan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh oleh senyawa yang terdapat pada permukaan fase diam dibagi dengan jarak yang ditempuh pelarut sebagai fase gerak. Nilai Rf dapat

dihitung menggunakan rumus

Nilai Rf dapat digunakan untuk menentukan kecepatan gerak pada zona relatif terhadap garis depan pengembang, serta dapat menunjukkan identitas asam amino yang dapat digunakan untuk pengukuran (Basset, 1998: 226).

Misalnya, ketika komponen merah menempuh jarak 1,7 cm dari garis dasar dan pelarut menempuh jarak 5,0 cm, maka nilai Rf untuk pewarna merah adalah:

Jika kita melakukan percobaan ulang dengan kondisi yang sama, maka nilai Rf akan selalu sama. Namun, jika terjadi perubahan pada kondisi seperti suhu dan komposisi pelarut, maka nilai Rf

akan berubah (Kumar, 2012: 128).

Praktikum pemisahan biokimiawi pigmen mata Drosophila melanogaster dengan Thin Layer Chromatography (TLC) dilakukan dengan tujuan agar praktikan dapat mengetahui prinsip kerja Thin layer Chromatography (TLC), dapat mengetahui serta memahami metode pemisahan biokimiawi pigmen mata Drosophila melanogaster, dapat mengetahui serta memahami pengaruh mutasi terhadap fenotipe, dapat membandingkan kromatogram Drosophila melanogaster normal dan mutan.