PEMISAHAN BIOKIMIAWI PIGMEN MATA Drosophila melanogaster
DENGAN THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC)”

 Kromatografi merupakan salah satu metode identifikasi yang dapat dilakukan untuk memisahkan suatu campuran berdasarkan perbedaan distribusi dari beberapa komponen pada fasa gerak dan fasa diam. Fasa gerak dapat berupa cairan atau gas, sedangkan fasa diam dapat berupa padatan atau cairan.

Pada Drosophila melanogaster terdapat beberapa tipe warna mata berdasarkan pigmen tertentu yang dipisahkan  melalui  pemisahan  biokimiawi.  Perbedaan  warna  mata  pada Drosophila  melanogaster normal  dan  mutan  dapat  dilihat  fenotipenya.  Pigmen  mata  pada Drosophila  melanogaster normal maupun mutan dapat dilihat dengan menggunakan metode Thin Layer Chromatography (TLC). Hal ini menjadi latar belakang dilakukannya praktikum pemisahan biokimiawi pigmen mata Drosophila melanogaster dengan metode Thin Layer Chromatography (TLC).

   Teori central  dogma mempunyai  prinsip yaitu  protein  dibuat  dari  RNA  yang  berasal  dari  DNA. Bunyi dari teori central dogma yaitu ketika DNA ditranskripsi, akan menghasilkan tiga RNA yang berbeda fungsi, yaitu mRNA, tRNA, dan rRNA. Secara singkat, mRNA ditranslasi menjadi protein dan tiap mRNA hasil translasi merupakan produk dari gen spesifik yang  menyintesis protein yang berbeda,  dengan  tujuan  untuk  meneruskan  informasi  genetik  (Klug,  2006:  232).  Aktivitas  gen merupakan  salah  satu  faktor  yang  memengaruhi  pembentukan  pigmen  mata  pada Drosophila melanogaster. Ketika terjadi mutasi pada mutan yang bersifat resesif, maka fungsi dari protein hilang. Hal tersebut menyebabkan adanya variasi warna mata pada Drosophila melanogaster mutan, karena terbentuknya pigmen warna mata yang beragam (Wolpert, 2002).

    Pigmen  warna  pada  mata  Drosophila  melanogaster  terbentuk  melalui  dua  jalur,  yaitu  jalur ommochrome coklat  dan pteridin merah. Jika  kedua  jalur  sintetis  ini  terganggu,  maka  tidak  ada pigmen  yang  dihasilkan  dan  menyebabkan  warna  mata  pada Drosophila  melanogaster berwarna putih. Jika yang terganggu hanya jalur ommochrome, maka mata Drosophila melanogaster berwarna merah  terang.  Jika  yang  terganggu  hanya  jalur pteridin,  maka  mata  Drosophila  melanogaster berwarna coklat. Jika sintesis drosopterin terganggu, maka mata Drosophila melanogaster menjadi mutan sepia, warna mata Drosophila melanogaster menjadi lebih gelap karena produksi sepiapterin yang berlebih. Beberapa pigmen yang dapat ditemukan pada jalur ommochrome yaitu kynurenine, N-formylkynurenine,  tryptophan,  xanthommatin,  3-hydroxykynurenine,  dan  sebagainya.  Sedangkan, pigmen yang dapat ditemukan pada jalur pteridin yaitu biopterin (biru), drosopterin (merah-jingga), isosepiapterin  (kuning), isoxanthopterin  (violet-biru), sepiapterin, tetrahydropterin, xanthopterin (hijau-biru),  2-amino-4-hydroxypteridin  (biru).  Warna  mata  pada  Drosophila  melanogaster dipengaruhi  oleh ada atau tidaknya  gangguan  pada  jalur  tertentu saat proses  sintesis (Garey,  dkk. 2000: 23-24).

    Kromatografi merupakan metode untuk memisahkan serta mengidentifikasi suatu komponen kimia di dalam suatu campuran. Prinsip kerja kromatografi yaitu interaksi molekul yang berbeda dengan menggunakan  medium  stasioner  (fase  diam)  dibawah  pengaruh  fase  gerak.  Hal  ini  menyebabkan komponen kimia tertentu terpisah dari suatu campuran (Sunardi, 2004: 50). Fasa gerak dapat berupa gas  atau  cairan,  sedangkan  fasa  diam  dapat  berupa  cairan  atau  padatan  (McNair  &  Miller,  2009).

Berdasarkan  fase  stasionernya,  kromatografi  dibedakan  menjadi beberapa jenis.  Yang  pertama, pemisahan  molekul  antara  pelarut  dan  fase  stasioner  padat  terhadap  molekul  terlarut  yang  disebut kromatografi  adsorpsi.  Kedua,  pemisahan molekul  antara  pelarut  dan  fase  stasioner  cair  terhadap molekul terlarut yang disebut kromatografi partisi. Ketiga, pemisahan molekul berdasarkan muatan molekul  terhadap  muatan  fase  stasioner  yang  disebut  kromatografi  pertukaran  ion.  Keempat, pemisahan molekul berdasarkan ukuran molekul terhadap matriks polimer yang disebut kromatografi penyaringan (Sunardi, 2004: 51). Kromatografi dapat digunakan sebagai metode pemisahan, metode analisis kualitatif, dan metode analisis kuantitafif (Rubiyanto, 2016: 6). 

    Adsorption  chromatography termasuk  dalam  kromatografi  kolom. Adsorption  chromatography dapat digunakan untuk memisahkan beberapa senyawa organik, senyawa nonpolar, serta konstituen yang sulit menguap (Sastrohamidjojo, 1991). Metode pemisahan pada adsorption chromatography berdasarkan adsorpsi beberapa komponen campuran dengan perbedaan afinitas terhadap permukaan fase diam. Adsorption chromatography disebut juga kromatografi cair-padat, yang dapat digunakan untuk analisis biokimia dan organik (Suryadarma, 2014). Paper chromatography termasuk kelompok kromatografi  planar  yang  pemisahannya  menggunakan  medium  pemisah  dalam  bentuk  bidang, umumnya  bentuk  datar  yaitu  kertas  (Sastrohamidjojo,  1991).  Prinsip  kerja paper  chromatography adalah pemisahan beberapa komponen dari substansi berdasarkan distribusi suatu senyawa pada fase diam dan fase gerak, pergerakan pelarut pada kertas, pergerakan komponen pada laju yang berbeda dan  pemisahan  campuran  berdasarkan  perbedaan  bercak  warna  (Suryadarma,  2014).  Paper chromatography  termasuk  kromatografi  partisi  yang  metodenya  sangat  sederhana,  dengan menggunakan sepotong kertas, tinta warna, dan pelarut. Dasar prinsip Paper Chromatography adalah proses pemisahan beberapa senyawa berdasarkan interaksi partisi atau distribusi senyawa pada fasa diam.  Senyawa  terlarut  pada  fasa  gerak  akan  melewati  fasa  diam  cair  yang  terdapat  pada  suatu padatan  pendukung  (Rubiyanto,  2016:  19-20). Thin  Layer  Chromatography  (TLC)  merupakan metode pemisahan komponen sebuah campuran berdasarkan perbedaan polaritas. Prinisp kerja Thin Layer Chromatography (TLC) yaitu ketika gaya kapilaritas menyebabkan larutan naik, maka pigmen akan  terbawa  ke  bagian  atas  kertas.  Karena adanya perbedaan pada kemampuan  kelarutan  dan kemampuan  untuk  membentuk  ikatan  hidrogen  dengan  kertas  kromatografi,  maka  pigmen  yang berbeda akan bergerak dengan jarak yang berbeda. Semakin lemah molekul yang membentuk ikatan, maka  semakin  cepat  pigmen  bergerak  ke  bagian  atas  kertas  (Pack,  2007:  262). Thin  Layer Chromatography (TLC) menggunakan perbedaan afinitas analit dengan pergerakan, serta fase diam untuk pemisahan senyawa kompleks dari suatu senyawa (Kumar, 2012: 126). Prinsip kerja adsorption chromatography adalah pemisahan antara zat terlarut serta fase gerak dengan permukaan fase diam.

Proses  pemisahan  pada  metode adsorption  chromatography  dipengaruhi  oleh  kekuatan  antara adsorben dan solute, serta kekuatan untuk memisahkan solute dari adsorben (Wati, 2014: 85).     Retention  factor  (Rf)  merupakan  hasil  kromatogram  yang  diuraikan  dalam  zona  tertentu  dan dideskripsikan  sebagai  perbandingan  jarak  yang  ditempuh  oleh  senyawa  yang  terdapat  pada permukaan fase diam dibagi dengan jarak yang ditempuh pelarut sebagai fase gerak. Nilai Rf dapat

dihitung menggunakan rumus

Nilai Rf dapat digunakan untuk menentukan  kecepatan gerak  pada  zona  relatif terhadap  garis  depan  pengembang,  serta  dapat menunjukkan  identitas asam  amino  yang  dapat  digunakan  untuk pengukuran  (Basset, 1998:  226).

Misalnya, ketika komponen merah menempuh jarak 1,7 cm dari garis dasar dan pelarut menempuh jarak 5,0 cm, maka nilai Rf untuk pewarna merah adalah:

Jika  kita  melakukan percobaan  ulang  dengan  kondisi  yang  sama,  maka  nilai  Rf akan  selalu  sama. Namun, jika terjadi perubahan pada kondisi seperti suhu dan komposisi pelarut, maka nilai Rf

 akan berubah (Kumar, 2012: 128).

    Praktikum pemisahan  biokimiawi  pigmen  mata Drosophila  melanogaster  dengan Thin  Layer Chromatography (TLC) dilakukan dengan tujuan agar praktikan dapat mengetahui prinsip kerja Thin layer  Chromatography (TLC),  dapat  mengetahui  serta  memahami  metode  pemisahan  biokimiawi pigmen mata Drosophila melanogaster, dapat mengetahui serta memahami pengaruh mutasi terhadap fenotipe, dapat membandingkan kromatogram Drosophila melanogaster normal dan mutan.

Author: greengorga